分子生物学技术在水产养殖上的应用

　　水产养殖是我国农业经济的支柱产业，在整个国民经济中占有十分重要的地位。从1990年起，我国水产品年总产量跃居世界*，并连续几年保持*。目前我国水产品总产量约占世界渔业总产量的1／4以上，其中水产养殖产量占世界产量一半以上，中国已成为世界水产养殖大国。但从20世纪90年代以来，水产养殖业日益面临三大问题：种质退化、疾病泛滥及环境污染，严重影响了水产养殖业的顺利发展。且养殖业大多还处在传统的低技术水平。这些因素与我国作为世界*水产养殖大国的地位极不相称。近些年来，新技术特别是分子生物学技术的发展和应用，已得到世界各国的普遍关注，被列为21世纪的重点科技发展领域。同样，分子生物技术在解决水产业技术难题，开拓新领域，改造传统产业中也具有十分突出的作用。特别是在水产育种、种质鉴定、病原体检测及疾病防治中的应用。
　　
　　一．分子生物学技术在水产育种与种质鉴定中的应用
　　
　　1.在水产动物基因转移中的应用
　　
　　鱼类属低等的脊椎动物，在整个生物进化中具有重要地位。鱼类每次可产大量的卵母细胞或受精卵，为转基因研究提供丰富的材料。且常行体外受精体外发育，使胚胎操作较简便。其多倍体和雌核、雄核发育较易成功，遗传可塑性大。从远缘杂交、细胞核移植等试验来看，不同种属甚至亚科之间的亲和协调较为容易。鱼卵发育成幼鱼的时间较短，且可通过改变环境温度等条件来控制发育速度。有些鱼类的卵具有透明的卵膜，可以方便地对胚胎发育的各个阶段进行观察和操作。因这些特点和养殖鱼类巨大的经济价值，鱼类常用作基因转移的对象。
　　
　　1转生长激素（Growthhormore，GH）基因鱼的研究
　　
　　生长激素是由垂体前叶分泌的一种单链蛋白，分子量为22kDa，具有促进机体生长发育，加速蛋白质合成以及脂类降解的生理功能。GH在水产养殖中具有重大的应用价值，因而受到普遍的重视。实验表明，如将外源GH注射到鱼体
　　
　　内，会有明显地促进蛋白质合成和降低饵料系数的作用。目前已克隆出20多种鱼的GH基因，有的已在大肠杆菌和酵母中表达，并应用于鱼类养殖。但更具吸引力的是人们希望用哺乳动物或鱼类的GH基因向鱼类转移以期获得有使用价值的个体大且生长迅速的“超级鱼”。虽然这种目标尚未实现，但亦有许多实验室获得了能够快速生长的转基因鱼。如转GH基因的大西洋鲑比正常的大3～5倍，个别达10倍以上（Duetal，1992；De—vlinetal，1995）。有些较大鱼类有类似枝端肥大的生长异常，但大多数鱼生长正常且可进行繁殖。第二代和第三代转基因鲑鱼已产生，他们生长比未转基因鱼快（Saundersetal，1998）。Mori和Devlin等（1999）检查了转红大马哈鱼Gh基因的银大马哈鱼的生长情况。转基因鱼生长速度大大加快，血清中GH水平提高约50倍。Northern法印迹检查GH的mRNA，结果发现，在大的转基因鱼体内，GH的mRNA水平低于小的转基因鱼。转基因鱼的脑垂体比正常的小。此结果暗示脑垂体GH的表达可能受到转入基因的负面影响（Mori等，1999）。
　　
　　2抗冻转基因鱼的研究
　　
　　许多鱼由于抗寒能力差，而需要通过季节性洄游来避免冻伤的危险，因而在养殖上受到限制。而南北极地区的海洋鱼类主要依靠血液中的抗冻蛋白或抗冻糖蛋白来降低体液的冰点，降低冰晶的生长速度，以防止因冻结而致死。因此，抗冻蛋白引起了有关人士的重视（Ewartetal，1999）。Fletcher等（1986）直接将
　　
　　纯化的冬季牙鲆的AFP（抗冻蛋白）注入鳟鱼体内，发现可在冻结温度下提供有效的保护，为以后的转基因研究提供了可行性。1988年他们又将冬季牙鲆的AFP的线性DNA经显微注射转入大西洋鲑的受精卵。从一些组织提取DNA进行PCR和Southern印迹分析，并对血清进行west—erh印迹分析和检测AFP的活性。结果表明，AFP基因已成功转入并整合到鲑鱼基因组，并在部分转基因鱼的F3代有AFP的持续表达，且检测到了AFP的活性（Fletcheretal，1988）。但由于缺乏形成成熟AFP的一种酶，因而只产生AFP原，活性约为成熟AFP的70％左右（Heweral，1999）。总之，AFP对低温下保护细胞膜的完整性和稳定性有重要作用，可增加对寒冷敏感鱼的耐寒能力。Wang，等（1995）的结果也显示转入冬季牙鲆AFP基因的幼龄罗非鱼可增加其对低水温的耐受能力。当然，要将AFP应用于实际，还有许多工作要做。
　　
　　3抗病转基因鱼的研究
　　
　　随着养殖业的发展，养殖密度的提高以及养殖环境与自然环境的差别使鱼类更易受到细菌、病毒、真菌和寄生虫的侵袭。鱼类的抗病基因研究得还不多，有些技术可用于转基因以增强抗病性。反义技术和核酶可中和消除某些病毒的RNA，如引起鲑鱼大量死亡的传染性造血组织坏死病毒的RNA。另一方式为表达病毒
　　
　　衣壳蛋白，如IHNV的66KDa的G蛋白，这样可占据病毒的受体，从而减少病毒的感染机会。但这些方法只限于一种或相关的病原。其他方法包括增强宿主自身的免疫反应，表达抗菌蛋白等。如*可抵抗多种细菌的侵扰，但不影响生物的其他功能，是进行抗病性转基因的一个良好选择。Hew等用*基因作为候选基因，开展转基因鱼的研究，以期获得可抗多种细菌病原的鱼。*是非特异性抵抗细菌侵入的酶，对抵抗病原体的侵入发挥重要作用，例如虹鳟的*对鳗弧菌、杀鲑气单胞菌、鲁氏耶尔菌和黄杆菌均有溶菌作用（Gride等，1989）。在鲑鱼体内的*水平与抗病性呈正向相关（Hew等，2001）。
　　
　　4其他转基因鱼的研究
　　
　　珠蛋白基因也是目前转基因鱼中常用的靶基因之一。这是因为鱼类耐低氧能力主要是由红细胞中血红蛋白含量决定的，而血红蛋白是由珠蛋白基因编码合成的。因此如能提高不耐低氧鱼类如虹鳟、鲢鱼、草鱼等的耐低氧能力，则可增加养殖密度，降低鱼类浮头泛塘的可能性，并大幅提高鱼产量。目前人们已对血红蛋白的分子结构、化学性质、生理功能以及珠蛋白基因的结构与表达等进行了较为详尽的研究。同时在哺乳动物身上，转兔珠蛋白基因的小鼠已研究成功，这些都为鱼类珠蛋白基因的转移奠定了基础。目前，日本科学家进行将鲤鱼珠蛋白基因载入虹鳟体内的研究，以期使虹鳟这种名贵鱼类能象鲤鱼一样，能耐低氧，不仅能在流水中养殖，也能在静水中养殖（Yoshizaka等，1991）。另外，绿色荧光蛋白（GFP）转基因的研究在观赏渔业将有很大潜力。通过GFP在不同组织的特异表达，将产生不同组织如眼、鳍条及尾发荧光的鱼。此外，现在还有不同颜色如蓝色、黄色、青色等的荧光，如通过选择组织特异性的启动子，产生多种荧光颜色的转基因鱼，如绿色肌肉、黄色眼睛、蓝色皮肤等。人类食用转基因鱼的研究由
　　
　　于考虑到人类的消费安全性而受到争议。在这一点上来讲，转基因观赏鱼的争议会少一些。
　　
　　5转基因藻
　　
　　藻类是光合自养的低等植物，分布非常广泛．是海洋生态系和人工养殖生态系的能量和物质基础，同时也是海洋药物、功能食品和精细化工产品的重要原料。目前组织培养、原生质体融合等传统生物技术已广泛应用于藻类研究．但应用分子生物学技术有目的地利用和定向改造藻类生物体系的研究呱I是近些年才得以开展。近几年来，从分子水平研究藻类个体发育与系统发育遗传机制的藻类分子遗传学研究发展较为迅速，并在此基础上，应用重组DNA技术^工构建藻类新品种以及实现藻类天然产物的基因工程生产的藻类基因工程研究也取得重要进展。近些年来，我国学者围绕构建藻类反应器表达生产蛋白和药物的目标，开展了较有特色的藻类基因、载体和表达系统的研究，并在转基因海带、鱼腥藻基因工程以及紫菜基因工程等藻类基因工程领域取得较太进展“”。目前用于藻类基因工程的目的基因主要有desA。acc1．apeAB，金属硫蛋白基因和超氧化物歧化酶基因等，用于基因转移的藻类表达系统主要有蓝藻、螺旋藻、海带、裙带菜、紫菜和江蓠等藻类。
　　
　　2.mP技术
　　
　　限制性酶切片段长度多态性（RFIP）指的是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后，古同源序列的酶切片段在长度上的差异。这种差异可以在电泳图谱上筛选并显示出来，并按孟德尔遗传定律分离。目前，RFLP技术已与PcR等技术联用，发展已相当成熟，在一些经济动植物多基因数量性状的基因定位等方面的研究与应用已取得重要进展，但在水产养殖业则刚起步。如有人将虹鳟线粒体I）NA的RFLP标记用于遗传分析．为种质鉴定和遗传育种提供依据。
　　
　　3.RAPI技术
　　
　　随机扩增多态性DNA（RAH]）技术是在PⅡ技术基础上发展起来的一项I3N多态性检测技术，其基本原理是利用一系列不同的碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸单链（常为十聚体）为引物，对所研究的D^模板基因组进行PCR扩增，通过对PCR产物的检测即可对基因组I3NA的多态性进行捡测。RAPD技术可以在对物种没有任何分子生物学研究背景的情况下，对其IINA进行多态性分析。而且与f、DNA指纹图谱法等其他D卜『A多态性检测技术相比，RAPD技术具有检预I效率高、样品用量少、灵敏度高等特点，因此广泛应用于农作物和畜禽品种及品系的鉴定、物种亲缘关系的确定、基因定位和分离以及构建基因图谱等方面的研究。尺目前RAPD技术也已用于水产品群体遗传差异分析，如用于高首鲟减数分裂雌核发育和多倍体的快速鉴定、对草鱼和鲤鱼的群体遗传变异进行研究、对甲壳动物遗传差异进行分析和对银鲫复合种外源遗传物质整入进行RAH）检测。
　　
　　4.rA指纹技术
　　
　　DNA指纹技术是分子生物学新兴技术之一。其基本依据是存在于基因组内的高度变异的重复序列微卫星IINA可与众多的基因组酶切片段进行杂交，得到具有个体特异性的指纹图谱。过种DNI~,指纹图谱具有高度种属和个体特异性．可以用于寻找遗传标记，进行遗传连锁分折；也可用于测定物种之间的遗传距离以及品种遗传纯度。因此可利用该技术测定物种的遗传距离，然后选用台适的亲本进行杂交，便提高杂种优势，获得产量高、生长迅速的新品种据}ng艘等1995年c盯等1991年、Gmc,s等1蜩4年报道，目前D指纹技术已应用于水产养殖中．如用于分析虹鳟的父本和母本对于代生长存活的影响对雌核生殖罗非鱼和小口黑鲈的不同群体进行鉴别。
　　
　　二．分子生物学技术在水产养殖病原体检测中的应用
　　
　　目前，我国水产养殖业尤其是虾类、贝类和鱼娄养殖业受到病原微生物的严重影响，因此如何快速准确预报和诊断水产动植物疾病，就成为当前水产养殖
　　
　　业十分重要而突出的问题。进些年来，分子生物学技术的迅速发展，已经有可能为水产养殖病原体的检测提供快速有效而且特异性强灵敏度高的技术手殷I
　　
　　1.单克隆抗体技术
　　
　　单克隆抗体技术是和b,ilstein于1975年发展起来的利甩杂交瘤细胞制备大量针对某一抗原决定簇的特异性抗体的技术。单克隆抗体与常规血清抗体相比，特异性强，能识别单一抗原决定簇，且容易制备．能通过保持细胞系重复获得相同抗体．因而在水产养殖病原体检测中得到广泛应用。如应用于诊断海湾扇贝（Argopect~iwadian~）的鳃立克次体、诊断与鱼类及牡蛎相结合的淋巴细胞毒、检测菲律宾蛤仔擦环病病因弧菌P1。另外，近年来已有^利用此技术制备了抗鳗孤菌的单克隆抗体和抗嗜水单胞菌外毒素的单克隆抗体。据陈琼等1996年报道，利用该技术制备的单克隆抗体可用于提纯嗜水气单胞菌hec毒素。
　　
　　2.酶联免疫吸附检剥
　　
　　酶联免疫吸附检测（EL]SA）是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行的一种检测技术。该技术将抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高教催化作用有机地结合起来．通过酶作用于底物后呈现的颜色变化来显示抗原抗体特异压应的存在，因此特异性强，灵敏度高．反应快速．结果可以定量，也可对抗原、抗体以及抗原抗体复合物进行定位分析。目前ELISA法水产养殖病原体诊断尤其在鱼病学谚断上应用较广。国内如钱冬等1993年用该法检测细菌性败血症病原——嗜水气单胞菌，陈怀青等1993年应用D：x-ELISA法检测鱼类致病性嗜水气单胞菌hec毒素，黄等1995年利用单克隆抗体酶联免疫技术捡测对虾皮下造血组织坏死病病毒，李焕荣等1997年应用Dot-ELISA法快速检测嗜水气单胞菌的致病因子胞外蛋白酶AhECPase54，均取得较为满意的教果。国外则鞍早用ELISA法对疖掩病、红嘴病、细菌性肾脏病和爱德华氏菌病等鱼类疾病进行快速诊断。另外，,Nod等0利用该法鉴定导致菲律宾蛤仔患棕环病的孤菌P1。
　　
　　3.核酸杂交技术
　　
　　核酸杂交技术是利用特定标记的EaNA或RNA探针和病原体生物中的与探补的靶核苷酸序列进行杂交，以此来确定宿主是否携带有病原体的一类分子生物学技术，可分为Southern杂交、Northern杂交和棱酸原位杂交。该技术以其灵敏高、特异性强和检验快速等优点，近年来在对虾病毒等水产养殖病原体检测中倍受青昧。如Futo等、t-~ney等1992年将此技术用来诊断细菌性鱼病，G∞等1996年应用地高辛标记的RNA探针检测FEV病毒在海洋鱼类中的表达，Bruce等1994年利用地高辛标记的DNA探针检测对虾扦状病毒。日本也有人利用地高辛标记的EI",IA探针进行菌落杂交用于鳗孤菌的鉴定；利用经PCR合成的探针与神经坏死病病毒c进行杂交选择亲鱼，可有效肪止病毒性神经坏死症（VNN）的垂直感染。我国的研究人员针对1993年米导致我国养殖对虾大规模死亡的病原——皮下及造血组织坏死杆状病毒（蛐帅v）已研制出相应的核酸探针，用于检测受该病毒感染的对虾。
　　
　　4.PcR枝术
　　
　　聚合酶链式反应（PcR）是体外酶促合成迅速扩增特异片段的一种方法。这项分子生物学技术产生虽仅数年，却以惊人的速度广泛地应用于分子生物学各个领域。目前PCR技术已用于水产养殖病原体检测的实际操作，如Cl~ng等1993年利用PCR技术成功地进行对虾病毒的扩增．Wang等1996年用PcR方法检测对虾杆状病毒，井获得了预计的扩增产物。另外，也有人应用PCR技术检测贝类肠道病毒以及水或水生生物体内富集的病毒和细菌。除应用于病原体检测外，PCR技术还与其他分于生物学技术联用，广泛应用于水产养殖业其他诸多领域。如应用于鱼类生长激素基因、各种cI~'QA分子的克隆；应用于检测外源基因是否整合入转基因鱼基因组中；应用于制作多基因家族基因组探针以及鱼类种群结构的遗传分析和种质遗传鉴定等。
　　
　　5.细胞培养
　　
　　动物细胞培养技术曾是一门自成体系的现代生物技术。近年来随着巳建成的数千种动物细胞系（株）被广泛应用于分子生物学研究，细胞培养技术已纳入分子生物学技术体系。水产动物细胞培养的研究，zui早起始于鱼类，如Wolf等1962年建立了虹鳟生殖腺ITI~2细胞系。同时也鱼类细胞培养研究开展得较为系统．巳建立的鱼类细胞系也较多。其中我国巳建立的部分鱼类细胞系如张念慈1981年建立的草鱼吻端组织二倍体ZC-7901细胞系，陈敏容等1985年建立的鲫鱼异倍体细胞系CAB-80，左文功等1986年建立的草鱼肾组织cⅨ细胞系，童裳亮等1989年建立的虹鳟巨噬细胞系。与鱼类相比，贝类、虾类等水产动物的细胞培养研究国内外报道较少．如Hanson等1976年建立了淡水蜗牛胚胎细胞系，徐亚立等zui近建立了斑节对虾细胞系。目前．动物细胞培养技术已应用于水产动物病原体检测，如L儿等1995年应用对虾淋巴器官原代培养细胞检测对虾黄头扦状病毒（YBV）。另外，水产动物细胞培养技术也可用于筛选抗癌药物、培育新品种以及生产疫苗和药物.
　　
　　三．分子生物学技术在水产养殖疾病防治中的应用
　　
　　鱼、虾、贝疾病严重威胁着水产养殖业的发展：目前，^们用来对付细菌性疾病的主要手段仍然是使用抗生素，但细菌适应性很强，较易产生抗药性．而且抗生索对病毒性疾病无能为力。固此除了要加强病原体检测之外，更重要的是要育抗病抗逆性强的水产养殖品种以及开发新的疾病防治技术。近些年来的实践表明，分子生物学技术在这些应用领域大有潜力可挖，如利用重组DNA技术导入病抗逆性基因获得抗病抗逆性强的转基因水产动植物另外也可将基因工程疫苗反义技术应用于水产养殖疾病防治。
　　
　　1.防止病毒传播
　　
　　病毒的传播有两种方式，垂直传播和水平传播。垂直传播是指亲本对子代的传播，利用单克隆抗体、核酸探针以及PCR等方法，对鱼虾贝进行无病原携带检测，选择健康的亲本进行育苗，是防止垂直传播的重要措施。如SPF（无特定病原虾）的选育就是一个较好的例子。水平传播主要是指水体环境中的带毒生物（轮虫、甲壳类等）或物质（粪便、饵料等）对健康个体的感染。运用生物技术对饵料等进行安全检测，能有效阻止病毒的水平传播。同时对水域环境（水质、底质等）进行定期检查，一旦发现病情，便可及时采取隔离或相应的防治措施，以缓解病
　　
　　情的进一步恶化。
　　
　　2.基因工程疫苗
　　
　　利用基因工程技术可将从细菌或病毒中分离出的具有免疫保护性的抗原因与载体接合，然后将此重组IT／qA转入大腑杆菌或酵母菌等体外表达系统中，从而大量生产作为疫苗用的抗原蛋白质。这种基因工程疫苗与常规疫苗相比，具有抗原专一、可应用发酵技术进行大量生产等优点。目前，许多国家已经制备出了基因工程疫苗，井在实际中应用。在水产养殖方面，欧、美、日本等已成功将弧苗、产气单胞苗、爱德华氏苗等鱼类病原菌制备成全细胞灭活疫苗，并且用从菌体中提取的脂多搪、胞外蛋白等有效抗原．制备出了单克隆抗体等生物工程疫苗并已商业化生产。如Cak|n等1988年将从传染性造血组织坏死病毒中分离到的糖蛋白基因G的,~u3AI片段转入埃氏大肠杆菌中，得到一种具有较强免疫原性的糖蛋白抗原，该基因工程疫苗能有效防治传染性败血症的感染。
　　
　　3.DNA疫苗
　　
　　即将裸露的DNA直接导入机体内，在体内表达已诱发免疫反应。Hansen等（1991）用含B一糖胶基因的质粒注射鱼肌肉，该基因得到了表达（Hansen等，1991）。经肌肉注射质粒DNA，其所携带的基因在体内表达特异蛋白，继而引起特异的体液免疫和细胞免疫，可达到保护鱼不受同源病原体的实验性感染。Anderson等（1996）用含CMV—IE启动子和IH—NV糖蛋白基因的质粒经肌肉注射虹鳟，6周后攻毒，其死亡率由原来的65％～75％下降到了15％～17％。Boudinot等（1998）用含cMV—IEP启动子和病毒性出血败血症病毒（VHSV）糖蛋白的质粒免疫成年虹鳟，也诱导产生了免疫性抗体。在另一组实验中，同样是IHNV的糖蛋白基因疫苗，免疫70d后攻毒，攻毒后30d内的死亡率仅为12％，而对照组为91％～96％（Kim等，2000）。
　　
　　4.反义技术
　　
　　反义技术是近十多年来发展起来的厦义棱酸技术和核酶技术的总称，可以用来特异性地阻断病毒功能的芷挥。厦义棱酸技术可分为反义RNA技术和反义[INA技术，但一般常指反义RNA技术。厦义RNA是I黼有义链为模板合成的RNA及其衍生物，它可通过与相应的mRNA互补结台而阻断其功能。目前，使用人工台成的厦义RNA已在原棱细胞和真棱细胞中成功地抑制了多种病毒基因的表达。
　　
　　棱酶则是一种具有催化作用的RNA，它通过碱基配对与靶RNA相互识别、结合并催化水解靶RNA，因此它既有反义RNA的作用，又能以序列特异性地切割靶RNA．。现已有不步研究显示棱酶可用于对病毒靶RNA进行切割。不过目前还未见到有关成功应用反义技术来治疗水产养殖动植物病毒性疾病的报道．但作为一种特异性鞍强的浩疗技术．反义技术还是很有应用开发潜力的。
　　
　　四．分子生物学技术在水域生态环境中的修复作用
　　
　　分子生物学技术除了在基因转移、疾病诊断与防治上有广泛的应用外，在生态环境的保护与修复上也有较好的发展空间。目前研究较多应用较广的主要是一些微生态制剂（光合细菌、益生菌等），这些有益微生物的共同特点是能够降低养殖环境中的氨氮、硫化氢、亚硝酸盐等，并能提高水体中的溶氧，对水域环境有一定的修复作用。此外，海洋研究人员应用酶工程技术，研发出各种工程菌，对海区养殖环境中的油污、卤代烃进行有效降解，提高了水体的自净能力，保护了生态环境，使生态效益与经济效益得以同步实现。
　　
　　分子生物学技术的发展与应用，带来的影响是的。作为一个养殖大国，我国的水产养殖业发展较快，但也面临着种质退化、病害猖獗、养殖环境恶化等诸多挑战。因此将这一新型技术应用于基因转移、病原检测、病害防治以及环境修复上具有广阔的发展前景和实用价值。并将对我国由传统渔业转向现代渔业，从养殖大国转向养殖强国产生深远影响。分子生物学技术不仅在水产养殖上可以培育生长快、抗寒、抗病的新品种,而且在水产动物疾病诊断上亦可显示其*的优势。传统的鱼病诊断主要依据肉眼观察、症状判别、显微境检查、微生物培养、表型分析、血清学分析、病理切片观察等,这些方法的诊断时程较长。而水产动物发病迅速,由于不能及时治疗而给生产造成重大损失。如鱼发病时,由于诊断结果尚未得出,人们往往大量使用氯制剂、硫酸铜和孔雀石绿等药物先行治疗,结果由于残毒影响,很难生产出健康的水产品。分子生物学技术的诞生,使水产动物疾病快速而直接的分子诊断得以实现。分子生物学技术在鱼病诊断上的应用,显示了其*的优势,可以为微生物病原体的鉴定提供直接的方法,不仅可以鉴定特定病原种类,也可以鉴定和区分出不同的品系和亚种;不仅可以鉴定微生物鱼病,也可以鉴定寄生虫鱼病。通过病原体遗传物质DNA的扩增诊断水产动物疾病,可*提高诊断的特异性和灵敏度;可缩短诊断的时程,使水产动物疾病诊断方式发生根本性的变革,大有替代传统诊断方法的趋势。